Maxima™ First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR
Opis
Sprawdź również proponowany zamiennik FastGene® Scriptase II cDNA Synthesis 5x Ready-Mix w atrakcyjnej cenie.
- Wysoka czułość i powtarzalność syntezy cDNA z szerokiego zakresu RNA (1 pg - 5 μg).
- Wysoki uzysk pełnej długości cDNA do 20 kb!
- Zwiększony współczynnik syntezy - całkowita synteza cDNA w czasie 15-30 minut
- Zwiększona temperatura reakcji do 65°C.
- Wygodny format - enzym jest dostarczany w gotowej mieszaninie (typu premixed)
Zastosowanie
- 2 step RT-PCR
- 2 step RT-qPCR
Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR jest wygodnym systemem zoptymalizowanym pod kątem syntezy cDNA w 2 step RT-qPCR. Zestaw zawiera zaawansowany enzym otrzymany na drodze ewolucji in vitro. Enzym charakteryzuje się znacznie wyższą wydajnością i termostabilnością w porównaniu z dzikim typem M-MuLV RT. Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR jest zdolny do powtarzalnej syntezy cDNA w szerokim zakresie ilości RNA wyjściowego (1 pg - 5 µg) w podwyższonej temperaturze (50 - 65°C). Reakcja syntezy może być zakończona w przeciągu 15-30 min. Oligo(dT)18 oraz losowe heksamery random hexamers są dostarczane w zestawie. Losowe heksamery są niespecyficzne i przyłączają się do każdego rodzaju RNA. Oligo(dT)18 przyłącza się selektywnie do końca 3’ poly(A) RNA i syntetyzuje cDNA wyłącznie z mRNa zakończonych poly(A). Startery specyficzne dla genów również mogą być wykorzystane z zestawem.
Składniki zestawu zostały przygotowane w taki sposób, aby zminimalizować ilość błędów związanych z pipetowaniem.
Skład zestawu
- RevertAid™ Maxima® Enzyme Mix zawiera transkryptazę Maxima® Reverse Transcriptase oraz inhibitor rybonukleaz Ribolock™, który skutecznie chroni RNA przed degradacją przez RNAzy A, B oraz C do temperatury 55 ºC.
- 5X reaction Mix zawiera: bufor reakcyjny, dNTPs, Oligo(dT)18, oraz random hexamers.
- Woda wolna od nukleaz
Rys. 1. Wysoka termostabilność Maxima® Reverse Transcriptase w 50°C.
Odwrotne transkryptazy były inkubowane w 1X buforze reakcyjnym. W wyznaczonych punktach czasowych 5-240 min. sprawdzono stopień aktywności.
Rys. 2. Amplifikacja matrycdo 20 kb w 2 step RT-PCR.
1 µg całkowitego RNA z komórek Jurkat (1 oraz 2) lub całkowite RNAz myszy mouse (3 oraz 4) zostało wykorzystane do reakcji odwrotnej transkrypcji z Maxima® Reverse transcriptase oraz innych odwrotnych transkryptaz w optymalnych warunkach dla każdego enzymu. Zsyntetyzowane cDNA zostało wykorzystane w PCR z Long PCR Enzyme Mix (#K0181) oraz starterami specyficznymi dla różnych genów:
1 – 6.8 kb POLE (ludzka polimeraza)
2 – 9.4 kb FBN1 (ludzka fibrylina 1)
3 – 13.3 kb Dmd (mysia dystrofina)
4 – 20.0 kb Neb (mysia nebulina)
M – GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder (#SM1331)
Rys. 3. Wysoce czuły 2 step RT-qPCR.
Amplifikacja całkowitego RNA w różnych ilościach z ludzkiego genu PPP1CA komórek JURKAT (5 µg, 2.5 µg, 1 µg, 100 ng, 10 pg, 1 pg). cDNA zostało zamplifikowane za pomocą zestawu Maxima® Probe /ROX qPCR Master Mix (2X) wraz z sondami TaqMan® assay specyficznymi dla genu PPP1CA. Reakcje przeprowadzono na instrumencie ABI 7500 Real-Time PCR. 1 pg całkowitego RNA został pomyślnie wykryty. Wydajność reakcji- 105%, nachylenie-3.29, R2=0.999.
Porównanie właściwości odwrotnych transkryptaz dostępnych w firmie Fermentas
Odwrotna transkryptaza | Optymalna temp. reakcji | Aktywna do temp. | Długość odczytu | Aktywność RNase H | Inaktywacja | Units/20 µl reakcji | Ilość całkowitego RNA/20 µl reakcji |
50-65°C | 65°C | 20 kb | + | 85°C, 5 min | 200 u | 0.01 ng - 5 µg | |
50-55°C | 60°C | 20 kb | – | 85°C, 5 min | 200 u | 0.01 ng - 5 µg | |
42-45°C | 55°C | 13 kb | – | 70°C, 10 min | 200 u | 0.1 ng - 5 µg | |
42°C | 50°C | 13 kb | + | 70°C, 10 min | 200 u | 0.1 ng - 5 µg |
Dane techniczne
Opakowanie | 200 react. |