Numer katalogowy:
EF0654
Wielkość opakowania:
300 U
Cena brutto:
37.80
FastAP™ Thermosensitive Alkaline Phosphatase jest aktywna we wszystkich buforach zarówno do PCR jak i dla enzymów restrykcyjnych.
Enzym defosforyluje wszystkie typy końców DNA w 10 min. w 37 stopniach C. Ze względu na inaktywację w 75 stopniach C (5 min.), nie potrzebne jest usuwanie enzymu przed ligacją.
Enzym defosforyluje wszystkie typy końców DNA w 10 min. w 37 stopniach C. Ze względu na inaktywację w 75 stopniach C (5 min.), nie potrzebne jest usuwanie enzymu przed ligacją.
Właściwości:
- Szybka defosforylacja: 10 min w 37°C.
- Szybka termiczna inaktywacja: 5 min w 75°C.
- Aktywna w buforach dla enzymów restrykcyjnych oraz PCR.
- Jeden protokół dla wszystkich rodzajów końców DNA.
- Aktywna w stosunku do nukleotydów.
Zastosowanie
- Defosforylacja wektorów do klonowania DNA w celu uniknięcia recyrkulizacji w trakcie ligacji.
- Jednoczesne trawienie i defosforylacja wektorów DNA.
- Oczyszczanie produktów PCR: degradacja nukleotydów w celu dalszego sekwencjonowania.
- Defosforylacja końca 5’ kwasu nukleinowego w celu znakowania kinazą polinukleotydową T4.
- Inne aplikacje gdzie niezbędna jest defosforylacja DNA lub RNA.
Przykładowe protokoły zastosowań
Oczyszczanie mieszaniny PCR przed sekwencjonowaniem
Procedura ta ma na celu usunięcie niewykorzystanych starterów oraz nukleotydów. Uzyskane w ten sposób produkty PCR są gotowe do sekwencjonowania i nie wymagają już dalszego oczyszczania np. na kolumnach.
1.
Przygotuj następującą mieszaninę:
|
Mieszanina PCR (bezpośrednio po zakończeniu PCR)
|
5 µl
|
|
Exonuclease I (EN0581/ EN0582)
|
0.5 µl (10 u)
|
|
FastAP™ Thermosensitive Alkaline Phosphatase
|
1 µl (1 u)
|
2.
Dobrze wymieszaj, a następnie przeprowadź inkubację w 37°C przez 15 minut.
3.
Zatrzymaj reakcję poprzez inkubację w 85°C przez 15 min.
Uwagi:
-
Do 5 µl oczyszczonych produktów PCR może być wykorzystane do reakcji sekwencjonowania bez dalszego oczyszczania.
-
Aby wyniki sekwencjonowania były rzetelne w mieszaninie nie powinno być niespecyficznych produktów PCR.
-
Protokół może być użyty do oczyszczania produktów PCR wygenerowanych przez każdą termofilną polimerazę DNA lub mieszaninę polimeraz.
-
Procedura nie jest polecana do dalszych aplikacji związanych z klonowaniem.
Usuwanie grup fosforanowych z końców 3’ i 5’ DNA oraz RNA.
Poniższy protokół jest przykładem defosforylacji ~ 3 kb liniowego vektora DNA.
1.
Przygotuj następującą mieszaninę:
|
Linearne DNA (~3 kb plazmid)
|
1 µg (~pmol termini)
|
|
10X FastAP™ bufor reakcyjny
|
2 µl
|
|
FastAP™ Thermosensitive Alkaline Phosphatase
|
1 µl (1 u)
|
|
Woda
|
Do 20 µl
|
|
Objętość końcowa
|
20 µl
|
2.
Dokładnie wymieszaj, krotko zwiruj i inkubuj w 37°C przez 10 minut.
3.
Zatrzymaj reakcję poprzez inkubację w temperaturze 75°C przez 5 minut.
Uwagi
-
Aby defosforylacja była wydajna DNA plazmidowe powinno być wolne od zanieczyszczeń RNA i DNA genomowego.
Logowanie
Kontakt