Fura-2

Fura-2 to jeden z najpowszechniej używanych indykatorów wapniowych w pomiarach racjometrycznych. Fura-2 jest szczególnie polecany w mikroskopii cyfrowej. Jest mniej podatny na fotoutlenianie (photobleaching) niż Indo-1. Przy zmianie kształtu komórki fluorescencja może być nieco zaburzona, w szczególności przy 340 nm i 380 nm. Na przykład intensywność sygnału fluorescencji przy tych długościach fali zmniejsza się wraz z napięciem komórek mięśni gładkich. W przypadku skurczu naczyń krwionośnych przy długości fali 340 nm wzrost intensywności sygnału fluorescencji wydaje się mniejszy, jednak już przy 380 nm jest zauważalnie większy. Fura-2-AM jest estrową pochodną acetoksymetylową związku Fura-2, która może być z powodzeniem włączana do komórek poprzez inkubację.

Fig. 1: Hydroliza estru Fura-2 AM.

Protokół (dla linii neuronalnej/NG 108-15)

Odczynniki:
• 1 mM Fura-2-AM/DMSO (1 mg Fura 2-AM w 1 ml DMSO),
• Hanks' balanced salt solution (HBSS),
• HEPES buffer saline (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 13.8 mM glukozy, pH 7.4).

Protokół:
• Założyć hodowlę komórkową w naczyniu o szklanym dnie (DMEM, 5% FCS).
• Zmienić pożywkę na 1 mM dibutyl cAMP/DMEM i hodować przez 3-4 dni indukując tym samym dendryty.
• Rozcienczyć roztwór 1 mM Fura-2-AM DMSO przy użyciu buforu HEPES uzyskując roztwór roboczy.
• Usunąć pożywkę i dodać 0,5 ml Fura-2-AM rozcienczonego z HEPES (roztwór roboczy)
• Inkubować 20 minut po czym usunąć pożywkę.
• Przepłukać komórki buforem HEPES. Inkubować przez 1 godzinę w buforze HEPES.
• Użyć komórki do fluorescencyjnej detekcji wapnia.
• Obserwować spektrum wzbudzenia przy 380 nm (bez wapnia) i 340 nm (kompleksy wapnia) oraz emisję przy 510 nm.

Warunki barwienia komórek zależą od ich typu. Protokół należy odpowiednio zmodyfikować dla każdego typu komórek.

Karty charakterystyki produktów dostępne są w formacie *.pdf po kliknięciu numeru katalogowego.

Zamawianie

Dostarczane w temperaturze pokojowej, przechowywać w -20 C.

Indykatory Fluo

Fluo-3 jest sondą wapniową o długiej fail. Fluo-3 w formie wolnej praktycznie nie posiada właściwości barwnika fluorescencyjnego. Stan ten zmienia się po związaniu wapnia i utworzeniu z nim kompleksów. Wówczas fluorescencje Fluo-3 wzrasta 60-80 razy. Sonda jest powrzechnie stosowana w laserowej mikroskopii konfokalnej (laser argonowy). Długa fala sygnału fluorescencyjnego pozwala na minimalizację fotouszkodzeń w komórkach. Fluo-3 jest idealna dla wykrywania wapnia w stanie 'caged'. Fluo-3-AM jest estrową pochodną acetoksymetylową związku Fluo-3, łatwo wnikającą do komórek podczas inkubacji.

Fig. 2: Chelatacja wapnia.

Protokół (dla ludzkich komórek T)*

Odczynniki:
• 2 mM Fluo-3-AM/DMSO (1 mg Fluo-3-AM w 442 ml DMSO)
• Pluronic F127
• Hanks' balanced salt solution (HBSS)
• HEPES buffer saline (10 mM HEPES, 1 mM Na₂HPO₄, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, 5 mM glukozy, 0.1% BSA, pH 7.4)

Protokół:
• Dodać 16.5 mg Pluronic F127 do roztworu Fluo 3-AM/DMSO. Pluronic F127 zapobiega formacji agregatów z Fluo-3-AM w HBSS i wspomaga pobieranie przez komórki.
• Rozcienczyć Fluo 3-AM w HBSS w celu przygotowania 4mM Fluo 3-AM (roztwór roboczy).
• Dodać Fluo 3-AM (roztwór roboczy) do komórek i inkubować przez 20 minut w 37°C.
• Dodać r objętości HBSS zawierające 1% FCS i kontynuować inkubację przez kolejne 40 minut.
• Przepłukać komórki 3 razy buforem HEPES. Zawiesić komórki w HEPES uzyskując 1 x 10⁵ komórek/ml.
• Inkubować przez 10 minut w 37°C. Następnie użyć komórki do detekcji wapnia.
• Monitorować fluorescencje przy 528 nm (wzbudzenie 490-500 nm)

Warunki barwienia komórek zależą od ich typu. Protokół należy odpowiednio zmodyfikować dla każdego typu komórek.

Karty charakterystyki produktów dostępne są w formacie *.pdf po kliknięciu numeru katalogowego.

Zamawianie

Dostarczane w temperaturze pokojowej, przechowywać w -20 C.