1. Fluo Cell Double Staining Kit - Zestaw do określania żywotności i cytotoksyczności komórek
2. Fluo Cell Counting Kit - Fluorometryczne określanie cytotoksyczności i żywotności komórek
3. Barwienie komórek - cytozol - Kalceina
   - Fallotoksyna

Fluo Cell Double Staining Kit - Zestaw do określania żywotności i cytotoksyczności komórek NOWOŚĆ

Fluo Cell Double Staining Kit jest używany do jednoczesnego barwienia komórek żywych i martwych. Zestaw zawiera roztwory Kalceiny-AM i jodku propidyny (PI), które barwią odpowiednio żywe i martwe komórki eukariotyczne.

Komórki HeLa po 15 min. barwienia: A - komórka żywa; B - komórka martwa

Kalceina-AM, jest barwnikiem wnikającym do komórek, pozwalającym na określenie ich żywotności. Kalceina-AM jest acetoksymetylową estrową pochodną kalceiny. Jest wysoce lipofilna, przez co przenika przez błonę komórkową organizmów eukariotycznych. Kalceina sama w sobie nie posiada właściwości fluorescencyjnych, natomiast jej ester w komórkach żywych emituje silne, zielone światło fluorescencji (wzbudzenie 490 nm, emisja 515 nm). Kalceina barwi tylko żywe komórki.

Jodek propidyny (PI), jest barwnikiem barwiącym jądra komórkowe. Nie może przenikać przez ciągłe błony komórkowe do wnętrza żywych komórek. Dlatego jest barwnikiem komórek martwych. Przenika do wnętrza martwych komórek poprzez uszkodzone w procesie apoptozy błony komórkowe i interkaluje z helisą DNA, emitując czerwone światło fluorescencji (wzbudzenie 535 nm, emisja 617 nm). Zarówno kalceina, jak i jodek propidyny, mogą być wzbudzane falą o długości 490 nm. Pozwala to na jednoczesne monitorowanie ilości żywych i martwych komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Przy wzbudzeniu falą 545 nm obserwujemy tylko komórki martwe. Ponieważ warunki barwienia komórek zależą od ich typu, ilości kalceiny i jodku propidyny, należy je odpowiednio zmodyfikować dla każdego typu komórek.

Jeden zestaw zawiera: Roztwór A (roztwór Kalceiny-AM, 1 mM w DMSO: 4 probówki (50 µl każda), Roztwór B (roztwór jodku propidyny (PI), 1.5 mM w H₂O): 1 probówka (300 µl).

Literatura:
E. S. Kaneshiro, et al., J. Microbiol. Methods, 17, 1 (1993); L. S. De Clerck, et al., J. Immunol. Methods, 172, 115 (1994); N. G.; Papadopoulus, et al., J. Immunol. Methods, 177, 101 (1994).

Fluo Cell Counting Kit - Fluorometryczne określanie cytotoksyczności i żywotności komórek NOWOŚĆ

Fluo Cell Counting Kit (FCCK) jest stworzony do fluorometrycznej detekcji komórek żywych. Ilość barwnika fluorescencyjnego - kalceiny jest wprost proporcjonalna do ilości żywych komórek. Ponieważ kalceina-AM jest wysoce lipidofilna (dzięki obecności grup acetoksymetylowych), bardzo łatwo wnika przez błony do wnętrza komórki.

Fot.1. Struktura kalceiny i kalceiny-AM

FCCK nie wymaga żadnych radioizotopów (takich jak w oznaczeniach z [³H]-tymidyną) ani rozpuszczania (tak jak w przypadku MTT).
Zakres detekcji - już od 50 lub nawet mniej komórek do przynajmniej 25 000 (Fot. 2).

Fot.2.

Fot.3.

Oznaczanie proliferacji komórek przy użyciu FCCK dobrze koreluje z oznaczaniem za pomoca przyłączania [³H]-tymidyny (Fot. 3), dlatego też, FCCK może skutecznie je zastąpić. Ponieważ osocze i fenol red interferują z pomiarem fluorescencji, należy wymienić pożywkę na D-PBS (-) przed dodaniem roztworu FCCK.

Zastosowanie:
Komórki przylegające i zawiesinowe.

Wymagany sprzęt i odczynniki:
- czytnik do płytek 96-dołkowych wzbudzanie: 490 ± 10 nm, emisja: 530± 15 nm,
- wirówka do płytek (dla komórek nieadhezyjnych),
- Dulbecco's Phosphate Buffered Saline bez Ca i Mg [D-PBS (-)],
- podstawowe narzędzia do pracy z kulturami komórkowymi.

Barwienie komórek - cytozol

Kalceina
Kalceina-AM, jest barwnikiem wnikającym do komórek, pozwalającym na określenie ich żywotności. Kalceina-AM jest acetoksymetylową estrową pochodną kalceiny. Jest wysocee lipofilowa przez co przenika przez błonę komórkową organizmów eukariotycznych. Kalceina sama w sobie nie posiada właściwości fluorescencyjnych, natomiast jej ester w komórkach żywych emituje silne, zielone światło fluorescencji (wzbudzenie 490 nm, emisja 515 nm). Kalceina barwi tylko żywe komórki. Barwnik jest dostępny jako roztwór w DMSO.

Fallotoksyna
Falloidyna MFP488 i falloidyna MFP555 to sondy o wysokim powinowactwie do F-aktyny. Falloidyna jest uzyskiwana z toksyn zawartych w pewnym gatunku grzyba, skonjugowana z jasnymi, fotostabilnymi barwnikami fluorescencyjnymi MoBiTec: zielonym MFP488 i czerwonym MFP555. Użyta w stężeniach nanomolarnych zapewnia wydajne znakowanie, identyfikację i oznaczanie ilościowe F-aktyny w kulturach komórkowych, ekstraktach bezkomórkowych, jak i w utrwalonych w formalinie tkankach.